Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования




НазваниеФедеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
страница3/6
Дата публикации16.03.2013
Размер1.08 Mb.
ТипПрактическая работа
litcey.ru > Биология > Практическая работа
1   2   3   4   5   6

Контрольные вопросы

1. Для чего используют куриные эмбрионы в вирусологии?

2. Каково строение развивающегося куриного эмбриона?

3. Какие методы можно использовать для заражения куриных эмбрионов вируса­ми?

4. Что вы знаете о методах индикации вирусов в куриных эмбрионах?

5. Какие способы получения вируссодержащего материала от куриных эмб­рионов вы знаете?

6. Каковы гемагглютинирующие свойства вирусов и их использование? Каков механизм гемагглютинации?
^ Практическая работа № 5

Культуры клеток и их использование в вирусологии

Цель работы - ознакомиться с теоретическими сведениями о культурах клеток, методами культивирования и видами культур клеток, а также хранением и способами контаминации.

Теоретические сведения. Культура клеток - это клетки многоклеточно­го организма, живущие и размножающиеся в искусственных услови­ях вне организма (in vitro).

Методика культивирования клеток особенно успешно стала раз­виваться после 40-х годов текущего столетия. Этому способствовали следующие обстоятельства: открытие антибиотиков, предотвращаю­щих бактериальное заражение культур клеток, открытие Хуангом (1943) и Эндерсом (1949) способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток (цитопатический эффект) - тудобный метод индикации вирусов в культурах клеток, и, наконец, Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и получения однослойных культур клеток.

В вирусологической практике применяют следующие культуры клеток: первично-трипсинизированные культуры клеток - клетки, полу­ченные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой. Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона). Однако лучше это удается сделать из эмбриональных ор­ганов, так как клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для этих целей используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных.

Для получения первичных клеток от здорового животного не поз­днее 2 - 3 ч после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают их на кусочки (1 - 4 мм) и обрабатывают ферментами: трипсином, панкреатином, коллагеназой и другими (чаще трипсином). Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивиру­ют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37 °С.

Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делиться. В развитии культур клеток различают несколько фаз: адаптации, логарифмичес­кого роста, стационарную и старения (гибель клеток). Размножаясь, клетки размещаются на поверхности стекла и при полном покрытии его в один слой контактируют друг с другом и прекращают делиться (контактная ингибиция).

На стекле формируется слой толщиной в одну клетку (поэтому эти культуры клеток называют однослойными или монослойными).

Обычно монослой формируется через 3 - 5 дней. Скорость его формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факто­ров.

Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7 - 21 дня (в зависимости от вида клеток и состава пита­тельной среды).

Интенсивность размножения клеток и состояние монослоя контролируют визуально под малым увеличением микроскопа (объектив х10). Лучше для этой цели использовать инвертированный микро­скоп.

Для культивирования вирусов используют молодые культуры клеток (как только сформировался монослой).

Субкультуры. В вирусологической прак­тике часто используют субкультуры, кото­рые получают из первичных клеток, выра­щенных в матрасах, путем снятия их со стекла раствором версена или трипсина, ресуспендирования в новой питательной сре­де и пересева на новые матрасы или про­бирки. Через 2 - 3 сут формируется моно­слой.

Практически субкультуру можно полу­чить из всех первичных культур клеток. (Хуже субкультивируются куриные фибробласты.) Субкультуры по чувствительно­сти к вирусам не уступают первичным культурам клеток, кроме того, они более экономичны, и есть возможность выявле­ния контаминации клеток вирусами. Суб­культуры получают от 2 - 5 пассажей (пе­ревивок) и очень редко до 8 - 10. Последу­ющие пассажи приводят к изменению мор­фологии клеток и их гибели. Если клеточные культуры прошли более 10 пассажей, они уже на ста­дии перехода к перевиваемым культурам клеток.

^ Перевиваемые культуры клеток - это клетки, способные к раз­множению вне организма неопределенно длительное время. В лабо­раториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в дру­гой (при условии замены питательной среды).

Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Обычно работа по полу­чению новых клеточных линий продолжается несколько месяцев. Полагают, что механизм происхождения перевиваемых культур клеток - результат генетической изменчивости клеток или селек­ции единичных клеток, присутствующих в первичной исходной культуре.

Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных клеток он диплоидпый), стабильны в условиях роста in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство ограничивает использова­ние перевиваемых культур клеток для культивирования вирусов при производстве вакцин.

Перевиваемые культуры клеток можно получать как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. Среди них наиболее широко используют следующие линии клеток: HeLa (из раковой опухоли шейки матки женщины); Нер-2 (из карциономы гортани челове­ка); KB (из раковой опухоли полости рта); ВНК-21 (почка новорожденного хомячка); ППЭС (перевиваемая почка эмбриона свиньи); ППТ (перевиваемая почка теленка); ППО (перевиваемая почка овцы); TR (из слизистой трахеи коровы); L (мышиные фибробласты). СОЦ (из сердца обезьяны циномольгус) и др. Перевиваемые клетки имеют преимущества перед первичными: их приготовление значительно проще, экономятся труд и матери­альные средства; эти культуры заранее можно проверить на нали­чие латентных вирусов и микрофлоры; клональные линии обеспе­чивают более стандартные условия для размножения вирусов, чем первичные, представляющие смешанную популяцию клеток. Большинство перевиваемых клеток обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные куль­туры.

Однако перевиваемые клетки имеют и недостатки: они склонны к малигнизации, т. е. злокачественное перерождение независимо от происхождения и снижения чувствительности к вирусам у них про­исходит быстрее, чем у первичных, поэтому необходимо применять клональные линии перевиваемых клеток.

Поддерживают перевиваемые клетки путем периодических пересевов. Чаще используют бесцентрифужный метод. Для оче­редного пересева отбирают 2 - 3-дневную культуру с хорошим монослоем, сливают питательную среду, а клеточный монослой покрывают подогретым до 35 - 37 °С 0,02%-ным раствором версена. Под действием версена клетки округляются, отделяются от стекла. Через 10 - 15 мин. после округления клеток версен сливают, оставляя небольшое количество и выдерживают еще 5 - 10 минут. Затем добавляют небольшое количество питательной среды. После встряхивания подсчитывают клетки в камере Горяева, исходную клеточную взвесь разводят ростовой питательной средой до необходимой концентрции (80 - 200 тыс. в 1 мл.) и разливают при помешивании в пробирки, закрывают резиновыми пробками и культивируют в термостате при 37 ºС в течение 3 - 4 дней до образования сплошного монослоя. Состав питательной среды зависит от вида клеток, но чаще при культивировании перевиваемых клеток используют среды Игла, 199 или смеси этих сред с гидролизатом лактальбумина.

^ Диплоидные культуры клеток. Это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченый срок жизни, характеризующаяся в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминатов и не обладающая туморагенной активностью при трансплантации хомячкам.

Диплоидные культуры клеток, так же как и перевиваемые, получают из первичных культур клеток. Кариотип клеток очень лабилен и при обычных методах культивирования клеток он изменяется в первые дни. Поэтому потребовались специальные методы обработки ткани, питательные среды высокого качества, фетальная сыворотка для длительного поддерживания клеток in vitro в диплоидном состоянии. Диплоидные клетки получают из различных тканей эмбриона человека (легкие, почки, кожно-мышечная ткань, сердце и др.) и животных ( почки эмбриона крупного рогатого скота, свиней, почки хомяка).

Диплоидные клетки в отличие от перевиваемых имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пасса­жей 50±10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Однако диплоидные клетки могут быть использованы в течение длительного времени, так как при каждом пассаже часть клеток можно заморозить (минус 196 °С) и при необходимости вос­становить.

Диплоидные клетки имеют преимущества перед перевиваемы­ми и первичными клетками: 10 - 12 дней они могут быть в жиз­неспособном состоянии без смены питательной среды; при сме­не среды один раз в неделю остаются жизнеспособны в течение 4 нед; особенно пригодны для длительного культивирования ви­русов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к ви­русам.

^ Суспензионные культуры клеток. В 1953 г. Оуэне с сотрудниками показали способность клеток размножаться в свободно суспендированном состоянии. В последующие годы этот метод был значительно усовершенствован: была создана современная аппаратура, обес­печивающая размножение клеток со строго заданными парамет­рами (температура, рН, скорость перемешивания), а также адап­тированы многие линии перевиваемых клеток к размножению в этих условиях (ВНК-21, Нер-2, МДВК и др.). Выращивание виру­сов в суспензионных культурах клеток открывает большие возмож­ности в промышленном производстве вакцин и диагностикумов. Однако только перевиваемые клетки хорошо культивируются в сус­пензии.

Новый подход к культивированию клеток в суспензии - приме­нение микроносителей (сефадекс, силикагель, цитолар и др.). На мик­роносителях культивируемые клетки формируют монослой. Таким образом, этот способ позволяет методами суспензионного культиви­рования выращивать зависимые от прикрепления к твердому субстра­ту клетки: первичные, субкультуры, диплоидные. Эти клетки приня­то называть поверхностно зависимыми.

Способ культивирования на микроносителях в настоящее время чрезвычайно популярен, так как он открывает большие перспективы в клеточной биотехнологии, в получении вакцин и других биологи­чески активных веществ (интерферон, гормоны и т. д.).

^ Хранение культур клеток. Каждый из трех основных типов кле­точных культур - первичных культур, диплоидных штаммов и пе­ревиваемых линий клеток, используемых в вирусологических иссле­дованиях, часто приходится консервировать, так как при продолжи­тельном пассировании клеток in vitro есть опасность бактериального загрязнения и неконтролируемых (генетических) изменений самих клеток.

Наиболее простой метод консервирования культур клеток - хранение их при 4 °С до 1 - 6 недель. Успешно применяют хранение клеточ­ных штаммов в условиях сухого льда (минус 78 °С) и жидкого азо­та (минус 196 °С). Для этого клетки снимают с матрасов, суспендируют в концентрации 106 в 1 мл питательной среды, содержащей в качестве защитных веществ 10 - 40 % сыворотки и 10 % очищен­ного стерильного глицерина (вместо глицерина успешно применя­ют ДМСО - диметилсульфоксид). Затем клеточную суспензию раз­ливают в ампулы, запаивают и выдерживают 1 -3 ч при 4 °С, после чего замораживают клетки в смеси этилового спирта с сухим льдом. Скорость охлаждения не должна превышать 1 °С в 1 мин. При сни­жении температуры до минус 25 °С ампулы помещают для хране­ния в сухой лед. Если для хранения используют жидкий азот, то ампулы с клетками охлаждают до минус 70 °С и кладут в жидкий азот. Хранение клеток в жидком азоте в течение ряда лет не изменяет их пролиферативную активность и чувствительность к вирусам.

Восстанавливают замороженные клетки следующим образом: ампулу с замороженными клетками быстро погружают в водяную баню на 1 - 2 мин при легком встряхивании, затем клетки выливают в матрас, добавляют соответствующее количество ростовой среды и культивируют в термостате при 37 °С. Для удаления глицерина или ДМСО питательную среду заменяют на следующий день после по­сева.

При транспортировке клеток матрасы с выросшим монослоем за­ливают средой доверху и закрывают резиновой пробкой. В лаборато­рии питательную среду сливают и используют при культивировании этих клеток в виде добавок к питательной среде, применяемой в дан­ной лаборатории.

Можно транспортировать и клеточную суспензию при 4 °С. При благоприятных условиях транспортировки, исключающих перегре­вание и замораживание клеток, 80 - 90 % из них сохраняют жизне­способность до 7 - 8 дней.

Работа с культурой клеток требует абсолютной стерильности, тщательной подготовки посуды, соответствующих растворов, пита­тельных сред и высокого качества воды.

^ Контаминация культур клеток. Работа с культурами клеток, их использование в вирусологических и других исследованиях, в био­технологии требуют постоянного контроля на отсутствие посторон­них агентов (контаминантов). Контаминантами могут быть вирусы, бактерии, грибы, микоплазмы и клетки других клеточных культур. Микоплазмы - одни из наиболее частых контаминантов, особенно в перевиваемых линиях клеток. Своевременное выявление их, дру­гих микроорганизмов или вирусов в культуре клеток - важное условие поддержания высокого качества последней. Паспортизация стабильных клеточных линий предусматривает в качестве необходи­мого теста контроль на отсутствие микоплазмоконтаминации, что должно стать обязательным для всех лабораторий, где работают с культурами клеток.

Резкое закисление питательной среды в культуральных флаконах и опалесценция ее могут быть следствием контаминации культур клеток микоплазмами. Для выявления последних используют следу­ющие методы: посев на питательные среды, тест-культуры, цитоло­гические, радиоавтографические и электронно-микроскопические.

В случае контаминации клеточные культуры уничтожают, а культивирование возобновляют из резервных расплодок, хранящихся в жидком азоте. Только редкие и уникальные культуры подлежат деконтаминации.

Предупредить размножение и подавить случайно попавшие в клеточную культуру бактерии удается с помощью противомикробных препаратов (антибиотиков и др.), добавляемых в росто­вые среды непосредственно перед их использованием. Эти пре­параты следует строго дозировать и применять дифференциро­вание. Их использование - необходимое условие при возрастании риска контаминации в процессе получения первичных культур клеток при крупномасштабном суспензионном выращивании кле­ток, массовом производственном культивировании перевиваемых клеток, а также во всех случаях объединения клеточного мате­риала.

При работе с культурами клеток используют многие антимикробных (нетоксичные) препараты в оптимальных дозах. Выбор эффективного препара­та или комплекса препаратов зависит от чувствительности к ним конкретных контаминантов.
Контрольные вопросы

  1. Какие виды культур клеток применяют в вирусологической практике?

  2. Откуда можно получить культуру клеток?

  3. Какие недостатки имеют перевиваемые культуры клеток?

  4. Расскажите о способах культивирования различных культур клеток.

  5. Что вы понимаете под хранением культур клеток?


Практическая работа № 6

Культивирование вирусов в культуре клеток.

^ Обнаружение вируса

Цель работы - Произвести культивирование вирусов в культуре клеток, обнаружить вирус в культуре клеток, ознакомиться с серологическими методами исследования

При культивировании клеток применяют диспергирующие раство­ры трипсина и версена. Раствор трипсина (0,25%-ный на фосфатном буфере) используют для разделения кусочков тканей на отдельные клетки и для снятия слоя клеток со стекла. Раствор версена - натри­евую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (0,02%-ный на растворе Хенкса) - используют для снятия клеток со стекла. Все ра­створы стерилизуют при соответствующих режимах.

^ Питательные среды. Различают естественные и искусственные (синтетические и полусинтетические) питательные среды.

Естественные среды состоят из смеси солевого раствора (Хенк­са, Эрла), сыворотки крови (животных или человека), тканевого (эм­брионального) экстракта (эмбрионов кур, коров, человека), коровьей амниотической жидкости и т. д. Количество каждого компонента в разных примесях сред значительно варьирует. Используют эти сре­ды редко.

В настоящее время применяют в основном искусственные пита­тельные среды. К полусинтетическим питательным средам относят ферментативные гидролизаты различных белковых продуктов: гидролизат лактальбумина, мышечный ферментативный гидролизат, ферментативно-казеиновый дрожжевой гидролизат, гемогидролизат, аминопептид и др. Наиболее широко используют в вирусологичес­кой практике 5%-ный раствор гидролизат лактальбумина, 5%-ный и 2,5%-ный раствор гемогидролизата.

Из синтетических сред наиболее широкое применение нашли среда 199 и среда Игла. В состав среды 199 входит более 60 компонентов; 20 аминокислот, 17 витаминов, компоненты нуклеиновых кислот, источники липидов, 8 минеральных солей и другие вещества. В со­став среды Игла также входит не менее 60 компонентов, включаю­щих аминокислоты, витамины, углеводы и т.д.

Во все питательные среды и некоторые солевые растворы добав­ляют индикатор феноловый красный (0,002 %) для определения кон­центрации водородных ионов (рН). В принятой концентрации он не оказывает токсического воздействия на клетки и вирусы. При сниже­нии рН среда желтеет, что позволяет определять момент ее закисления продуктами метаболизма клеток до уровня, требующего замены среды на свежую; при сдвигах рН в щелочную сторону растворы при­нимают красно-малиновый цвет. При нейтральном значении рН (7,2 - 7,4) цвет среды оранжево-красный. Для регулирования рН солевых растворов и питательных сред используют 7,5%-иый раствор бикар­боната натрия (NaHCO3) и 3%-ный раствор уксусной кислоты (СН3СООН).

Для уничтожения микрофлоры перед использованием в среды добавляют антибиотики: пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл. Для подавления плесени используют натриевую соль нистатина по 100 мкг на 1 мл среды.

^ Все питательные среды принято делить на две группы:

1 - ростовые, обеспечивающие жизнь и размножение клеток. Они содержат 2 - 10 % сыворотки крови, применяются в первые дни культивирования клеток;

2 - поддерживающие, обеспечивающие жизнедеятельность клеток, но не размножение их. Они не содержат сыворотки крови, используются обычно после заражения культуры клеток вирусами.

Сыворотка крови крупного рогатого скота - обязательный ком­понент ростовых питательных сред. В ее состав входит ряд биологически активных веществ, необходимых для роста клеток in vitro. Coдержащиеся в сыворотке активная фракция альбуминов и фетуин способствуют прикреплению клеток к поверхности стекла. В прак­тической работе наибольшее применение нашли сыворотки как взрос­лого крупного рогатого скота, так и телят, получаемые на мясоком­бинатах. Самая лучшая сыворотка для культуры клеток - сыворотка эмбрионов коров. При получении сыворотки следует соблюдать строгую стерильность. Каждая серия сыворотки проходит контроль на стерильность и токсические свойства по отношению к культурам клеток.

Посуда. Качество посуды имеет важное значение для успешного культивирования клеток вне организма. Посуда должна быть стериль­ной, обезжиренной, не обладать токсическим действием. Для куль­тивирования клеток используют пробирки, матрасы на 50, 100, 250, 500, 1000 и 1500 мл, роллерные колбы на 500, 1000, 2000 мл, различ­ные пипетки, флаконы для питательных сред и растворов, колбы раз­личной вместимости, воронки и др.

Предложено много способов обработки посуды, и в каждой лабо­ратории применяют один из них, наиболее экономичный, удобный и дающий наилучшие результаты. При культивировании клеток осо­бенно большие требования предъявляют к подготовке и стерилиза­ции посуды, пробок и др. Во многих случаях неправильная их мойка и стерилизация служат причиной неприкрепления клеток к стеклу или быстрой дегенерации клеточного монослоя.

При обработке посуды необходимо учитывать высокую чувствительность клеток к токсическому действию солей тяжелых металлов. Одним из обязательных условий успешной работы с клетками является высокое качество воды. Для ополаскивания посуды ис­пользуют дистиллированную, а лучше бидистиллированную или деионизированпую воду.

Обработка стеклянной посуды состоит из нескольких этапов:

1) инфицированную посуду погружают в 2 - 3%-ный раствор , NaOH на 5 - 6 ч;

2) споласкивают в 3 - 4 сменах водопроводной воды;

3) замачивают (на ночь) в 0,3 - 0,5%-ном растворе порошка «Ло­тос», «Лоск » или мыла Б;

4) тщательно моют с помощью ерша в теплом растворе порошка

«Лотос» или «Лоск»;

5) споласкивают в нескольких сменах (8 - 10 раз) водопроводной

воды;

6) споласкивают в дистиллированной воде, содержащей 0,5 % НС1;

7) споласкивают 4 - 5 раз водопроводной водой и в трех сменах дистиллированной воды;

8) сушат в сушильном шкафу;

9) монтируют и стерилизуют в сушильном шкафу (180 °С, 3 - 4 ч), кроме резиновых пробок, или автоклавируют (при 200 кПа 1,5 - 2ч).

Всю новую посуду моют теплой водой с мылом, споласкивают водой и погружают на 3 ч в хромник (100 г двухромовокислого калия на 1 л концентрированной серной кислоты), затем в течение 9 ч про­мывают в проточной воде и нескольких сменах дистиллированной воды, сушат, монтируют и стерилизуют. Старую, бывшую в употреб­лении посуду обрабатывают хромником лишь периодически и не бо­лее чем в течение 1 ч.

Новые резиновые пробки кипятят 1 ч в 5%-ном растворе двуугле­кислой соды, затем промывают несколько раз горячей водопроводной водой и кипятят каждый раз по 1 ч в шести сменах дистиллированной воды. Пробки, бывшие в употреблении, автоклавируют или кипятят 1 ч. Очищают щеткой, прополаскивают несколько раз водопроводной и один раз дистиллированной водой. Затем кипятят в дистиллирован­ной воде 1 ч, споласкивают в трех сменах дистиллированной воды, стерилизуют в автоклаве.

Металлические инструменты моют горячей водой с мылом, про­мывают водопроводной и дистиллированной водой, стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 30 мин. Во время работы в стерильном боксе инструменты находятся в стакане с 96%-ным этиловым спиртом, перед использованием инструменты прожи­гают пламенем горелки.

В настоящее время ни одна вирусологическая лаборатория не мо­жет обойтись без культуры клеток. Культуры клеток имеют следую­щие преимущества перед лабораторными животными и куриными эмбрионами:

-можно добиться заражения практически всех культур клеток, что позволяет получать вируссодержащий материал с наивысшей концен­трацией вируса при наименьшем содержании белкового балласта;

-поскольку можно получить культуры клеток любого вида живот­ного, снимаются видовые ограничения культивирования вирусов; возможно вмешательство в инфекционный процесс в любой момент, не нарушая целостности живой системы.

-можно непрерывно контролировать ход инфекционного процесса;

-возможно получение готовой суспензии вируса в виде культуральной жидкости;

-соблюдается полная стерильность культуральной жидкости в от­ношении грибов и бактерий;

-предельно просты техника заражения и получение вируссодержащего материала; относительная дешевизна.

Культуры клеток - наиболее совершенная из лабораторных сис­тема для культивирования вирусов. В вирусологической практике культуры клеток чаще всего используют для первичного обнаруже­ния вирусов и их выделения из патологического материала, накопле­ния вируса при изготовлении вакцин и диагностикумов, поддержа­ния вирусных штаммов в лаборатории, титрования вирусов и как тест-объект в реакции нейтрализации.

Для успешного выделения вируса необходимо соблюдать следующие требования:

- используемая культура клеток должна быть чувствительной к предполагаемому вирусу. Чувствительность ее повышается, если клетки получены от молодых животных (лучше эмбрионов);

- инокулируемый вирус не должен быть старым, долго хранившим­ся, так как определенная часть инактивированного вируса в популя­ции подавляет размножение вирулентных частиц. Вирулентность вируса повышается в результате серийных, быстро чередующихся в, пассажей предельных разведении;

- культивирование проводят при определенном соотношении виру­са и клеток, т. е. при определенной множественности заражения. В качестве средней величины рекомендуется 106 - 104 ТЦД 50 на 10 млн клеток;

- поддерживающую среду добавляют после того, как вирус прикре­пится к клеткам - адсорбируется (обычно это происходит через 1 - 2 ч при 22 или 37 °С в зависимости от вируса). Распределение вируса в монослое при заражении должно быть равномерным;

Оптимальная температура для размножения вируса 36 - 38 °С. Длительное нахождение образовавшегося свободного вируса в теплой среде приводит к его инактивации.

Лучше всего получать вирус при 75 % цитопатического действия. Культивирование вирусов в культуре клеток. Методика его вводится к следующему; подбору культуры клеток; получению вируссодержащего материала; подготовке для заражения; заражению клеток вируссодержащим материалом; культивированию вируса в клетках; индикации вируса в культуре клеток; сбору культуральной жидкости и идентификации в ней вируса.

^ Подбор культур клеток. Не всякая клетка чувстви­тельна к любому вирусу. Вирус к первичной культуре обычно ус­пешно адаптируется при условии, если культура получена из орга­нов животного, естественно восприимчивого к данному вирусу. Од­нако адаптация вируса к перевиваемым клеткам более сложна, а в ряде случаев неосуществима. Для культивирования некоторых ви­русов до сих пор неизвестно ни одной клеточной системы. Для куль­тивирования вируса используют обычно молодые клетки, т. с. в пер­вый день формирования монослоя, а в некоторых случаях (для парвовирусов свиней) клетки заражают при их посеве, так как вирус интенсивно размножается при наличии делящихся клеток (когда они находятся в стадии логарифмического роста).

^ Заражение клеток. Для этого отбирают пробирки (или матрасы) со сплошным клеточным монослоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Ростовую питательную среду сли­вают, клетки 1 - 2 раза промывают раствором Хенкса, чтобы удалить сывороточные антитела и ингибиторы. В каждую пробирку вносят по 0,1 - 0,2 мл вируссодержащего материала и покачиванием распре­деляют его равномерно по слою клеток. В таком виде пробирки (мат­расы) оставляют от 1 до 2 ч при 22 или 37°С для адсорбции вируса на поверхности клеток. Затем вирус, содержащий материал удаляют из пробирок (матрасов) и наливают поддерживающую среду (в пробирку 1 - 2 мл, в матрасы около 10 % его объема). При выделении вируса из патологического материала некоторые пробы фекалий и др.) могут оказывать токсическое действие на клетки, поэтому после адсорбции вируса монослой клеток отмывают 1 - 2 раза раствором Хенкса (или питательной средой) и затем наливают поддерживаю­щую среду.

^ Культивирование вируса. Пробирки (матрасы) за­крывают герметически резиновыми пробками и ставят на инкубацию в термостат при 37 °С. Наиболее широко применяют стационарное инкубирование. При этом матрасы кладут в горизонтальном положе­нии, пробирки - под углом 5° так, чтобы монослой клеток оказался под питательной средой (чертой вверх). В ряде лабораторий заражен­ные культуры клеток инкубируют на вращающейся системе - рол­лерах. Используя этот метод, удается получать большой выход вируса, имеющего более высокий инфекционный титр, чем при стационарном культивировании.

Для каждой пробы материала обычно используют не менее 4 - 10 пробирок с культурой клеток. Для контроля оставляют 4 - 6 пробирок с незараженной культурой клеток, в которых заменяют ростовую среду на поддерживающую.

В культурах клеток, зараженных вирусом, питательную среду мож­но не менять в течение 7 дней, а рН среды (6,9 - 7,4) поддерживать с помощью 7,5%-ного раствора бикарбоната натрия. При более дли­тельном культивировании инфицированных клеток (аденовнрусы и др.) среду меняют.

Все пробирки (матрасы) после заражения клеток ежедневно исследуют под малым увеличением микроскопа, сравнивая культу­ры клеток, зараженные вирусом, с контрольными.

В термостате адсорбировавшиеся на клетках вирусные части­цы проникают внутрь их и начинается их репродукция. Новые вирусные частицы покидают (полностью или частично) клетки, в ко­торых они образовались, проникают в непораженные клетки, репро­дуцируются в них, переходят в новые клетки и поражают их. Так про­должается до тех пор, пока есть живые неповрежденные клетки. В результате этого процесса практически вес клетки в матрасе или про­бирке поражаются вирусом, хотя абсолютно все почти никогда не поражаются.

Вирус накапливается в основном в культуральной жидкости, но часть вирионов может оставаться и внутри не разрушенных вирусом клеток. Чтобы оставшийся в клетках вирус освободить, клетки тща­тельно разрушают или многократным замораживанием - оттаива­нием (2 - 3 раза), или с помощью ультразвука.

^ Индикация (обнаружение) вируса в культуре клеток. Существуют следующие основные мето­ды индикации вируса в культуре клеток: по цитопатичсскому эффек­ту или цитопатическому действию (ЦПЭ, ЦПД); по положительной реакции гемадсорбции (РГАд); по образованию бляшек; по обнару­жению внутриклеточных включений; но выявлению вирусов в реакции иммунофлуоресценции (РИФ); по обнаружению интерференции вирусов; по подавлению метаболизма клеток (цветная проба); элект­ронной микроскопией и др.

ЦПД. Наиболее широко и часто о размножении вируса в куль­туре клеток судят по цитопатичсскому эффекту или цитопатическому действию. ЦПД называются любые изменения клеток в культуре клеток под влиянием размножающегося в них вируса. Физиологические изменения клеток установить довольно слож­но, а морфологические изменения обнаруживаются довольно легко. Для этого достаточно положить на предметный столик микроскопа пробирку или матрас слоем клеток вверх и, исполь­зуя малое увеличение (объектив х8 - 10, окуляр х7 - 10), осмот­реть слой. Полезно сравнить клетки, зараженные вирусом, с та­кими же клетками в пробирке, не подвергавшимися заражению. В этом случае практически любые наблюдаемые в микроскоп от­личия зараженной культуры клеток от контрольной можно счи­тать проявлением ЦПД. Эти отличия могут захватывать весь мо­нослой или отмечаться только в виде небольших очажков изме­ненных клеток в слое нормальных клеток. Интенсивность ЦПД выражается тем, какая часть клеточного монослоя изменена ви­русом. Хотя общепринятой системы оценки интенсивности ЦПД нет, ее часто оценивают в крестах или баллах. Так, если измене­нию (по сравнению с контролем) подвергся весь монослой в про­бирке или матрасе, ЦПД оценивают на четыре креста, если 3/4 на три, если 1/2 на два креста, на один крест. Но эти оценки все же весьма условны. Формы ЦПД зависят от биологических свойств вируса, вида кле­ток, дозы заражения, условий культивирования и т.д. Одни вирусы проявляют ЦПД через 2 - 3 сут после заражения (энтеровирусы), другие - через I - 2 нед (аденовирусы).

Ряд авторов пытались сгруппировать сходные формы ЦПД. У од­них получилось 23 формы, у других - 11, у третьих - 5 и т.д. Но, наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД:

^ Фрагментация клеток, округление клеток, симпластообразование.

Фрагментация - разрушение клеток на отдельные фрагменты, ко­торые отделяются от стекла и переходят в культуральную жидкость в виде клеточного детрита (вирус везикулярного стоматита).

Округление - потеря клетками способности прикрепляться к стеклу, вследствие чего клетки, обычно распластанные по стеклу, при­нимают шаровидную форму, отделяются от стекла и свободно плава­ют в культуральной жидкости, где и погибают (энтеровирусы, адено­вирусы и др.).

Симпластообразование - растворение клеточных оболочек, вследствие чего цитоплазмы соседних клеток сливаются, образуя одно целое, в котором располагаются (главным образом по пери­ферии) ядра клеток. Такие образования из цитоплазматической массы с многими клеточными ядрами называются симпластами (гигантские многоядерные клетки). Их образование объясняют двояко: нарушением процесса деления клеток под влиянием вируса или тем, что некоторые вирусы содержат фермент (лецитиназу), который растворяет клеточные оболочки, в результате цито­плазмы расположенных рядом клеток сливаются. ЦПД в культуре клеток способно вызывать большинство вирусов, поэтому этот ме­тод индикации вирусов в культуре клеток применяют очень широ­ко. Однако есть вирусы, которые, размножаясь в культуре клеток, ЦПД не вызывают (вирусы бешенства, классической чумы сви­ней, некоторые штаммы вируса диареи крупного рогатого скота и др.). Клетки остаются жизнеспособными, но интенсивность кле­точного деления понижается, со временем изменяется и их мор­фология.

При неопластической трансформации пораженных клеток в мо­нослое образуются плотные фокусы трансформации различной ве­личины и формы, белого цвета (вирус саркомы Рауса).

Отсутствие ЦПД в первом пассаже еще не говорит об отсутствии вируса, который не всегда размножается настолько быстро, чтобы вызвать ярко выраженное ЦПД. Поэтому и прибегают к «слепым» пассажам. Необходимо провести не менее трех «слепых» пассажей, прежде чем судить о наличии вируса в исследуемом материале.

Гемадсорбция - соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток - впервые была обнаружена Фогелем и Щелоковым (1957) на культуре ткани, инфицированной вирусом гриппа. В последующем: выяснилось, что этой способностью обладает ряд других вирусов: парагриппозные, осповакцины и оспы, ньюкаслской болезни, гриппа млекопитающих и птиц. Наиболее ценным оказалось применение этой реакции для выявления и идентификации парагриппозных вирусов животных (ПГ-3 крупного рогатого скота, парагриппа овец, вируса Сендай). В основе этого явления лежит род­ство рецепторов вируса, находящихся на поверхности пораженной клетки, с рецепторами эритроцита, что приводит к их взаимному сцеплению аналогично реакции гемагглютинации. Преимущество этой реакции состоит в том, что она становится положительной еще до появления отчетливых цитопатических изменений в инфицирован­ных клетках. Для постановки реакции используют эритроциты морс­кой свинки, обезьян, человека (группы О) и другие эритроциты, чувствительные к гемагглютинирующему действию изучаемого виру­са.

Методика РГАд состоит в следующем. На 3—4-й день после инфицирования клеток берут две пробирки с одинаковой культурой кле­ток, из которых одна заражена виру с содержащим материалом, а вто­рая контрольная. Из обеих пробирок сливают культуральную жид­кость и вносят в обе по 2—3 капли 0,5%-ной суспензии отмытых эрит­роцитов. Обе пробирки оставляют на 5—10 мин так, чтобы эритроциты были на поверхности клеток (кладут горизонтально на стол), а затем слегка споласкивают физраствором и исследуют под микроскопом (малое увеличение). В контрольной пробирке эритроциты полнос­тью удаляются с физраствором, а некоторые из оставшихся плывут вместе с жидкостью. Если в зараженной пробирке эрит­роциты не удалились с физраствором и не плывут, а прикреплены к поверхности клеток, следует считать РГАд положительной.

В зависимости от вируса и вида клеток расположение эритроци­тов может быть трояким:

эритроциты адсорбированы только по периферии клеточно­го пласта в виде «ожерелья» (вирус африканской чумы свиней);

эритроциты расположены на слое клеток очагами или скопления­ми (вирус гриппа);

эритроциты расположены на слое клеток диффузно (вирус парагриппа).

Каждый вирус способен адсорбировать эритроциты крови животных определенных видов. Если вирус на данной культуре клеток вызывает и ЦПД, и РГАд, то гемадсорбция проявляется раньше, чем ЦПД. Метод этот пригоден для индикации в куль­турах клеток только некоторых вирусов и поэтому применяется нечасто. Однако для индикации ряда вирусов (вирусы африканс­кой чумы свиней, парагриппа-3 крупного рогатого скота и др.) он незаменим.

При отсутствии гемадсорбции на 3—4-й день после инфицирования через каждые 2—3 дня берут следующие пробирки с инфициро­ванной культурой клеток и ставят РГАд по описанной выше методи­ке. Пробирки с культурой клеток находятся под наблюдением в тече­ние 14—20 дней. При отрицательной реакции гемадсорбции в первом пассаже проводят следующий пассаж и РГАд.

РГАд используют для обнаружения вируса в культуре клеток, для титрования его и при постановке реакции нейтрализации с целью определения титра антител в сыворотках крови животных.

^ Метод образования бляшек. Этот метод обнаружения вирусов технически сложнее других и применяется главным образом для титро­вания вирусов.

Дальбекко и Фогт в 1954 г. впервые предложили методику получения бляшек под агаром в культуре куриных фибробластов с вирусом западного лошадиного энцефаломиелита. В последу­ющие годы многие авторы с успехом применяли этот метод при изучении различных вирусов - ящура, везикулярного стоматита, ньюкаслской болезни, чумы птиц, полиомиелита, Коксаки и др. Метод бляшек стали широко применять в вирусологии для получения чис­тых популяций вируса, особенно при изучении их генетических свойств. Методику получения бляшек, предложенную Дальбекко и Фогт, модифицировали, и в настоящее время есть целый ряд отличных друг от друга методов, связанных с изучением различных вирусов.

Метод бляшек основан на образовании вирусом в одпослойных культурах, залитых агаровой средой, содержащей витальный краси­тель нейтральрот, негативных колоний или бляшек. Бляшки представляют собой обесцвеченные участки культуры, со­стоящие из погибших под действием вируса клеток. Кроме агара в целях предотвращения переноса вируса на другие места можно ис­пользовать крахмал и метилцеллюлозу. Некоторые вирусы дают бляш­ки без покрытия слоем агара, например вирус чумы крупного рогатого скота, осповакцины, некоторые представители вирусов герпеса и др.

При постановке бляшек особое внимание должно быть обра­щено па качество культуры, она должна иметь сплошной рост клеток без признаков дегенерации. Лучше всего использовать культуры, выращенные во флаконах или матрасах различного типа. На клетки, промытые средой или раствором Хенкса, нано­сят вирус в определенных разведениях и обеспечивают контакт вируса с клетками при периодическом покачивании в точно ус­тановленный отрезок времени (1 - 2 ч) при 37 - 38 °С. Неадсор­бировавшийся вирус удаляют путем промывания раствором Хенкса или отсасывают пастеровской пипеткой, затем на слой клеток наносят специальное агаровое покрытие. Выбор среды покрытия определяется видом клеток и вируса.

Обычные компоненты агарового покрытия - агар, раствор Эрла, телячья сыворотка, нейтральный красный, раствор соды (NaHCO3.),среда, антибиотики.

После застывания (30 - 60 мин) с поверхности агара сливают конденсированную влагу, флаконы переносят в термостат и инкубируют клетками вверх. Время инкубации и температура должны быть оптимальными для бляшкообразования, вызываемого данным вирусом. Наблюдение за появлением бляшек проводят в течение нескольких дней. За это время вирусы, адсорбировавшиеся на клетках, проника­ют в последние, проходят цикл репродукции, выходят из клеток и поражают соседние клетки. В сплошном слое живых клеток возни­кают островки мертвых, погибших вследствие репродукции в них вируса клеток. Раствор красителя окрашивает только живые клетки. Поэтому в матрасе на ровном красновато-розовом фоне появляются бесцветные пятна, которые и называются негативными пятнами Дальбекко или бляшками. Каждая бляшка соответствует островку мерт­вых клеток. Бляшки в культуре клеток образуют многие вирусы. При большой плотности (соответствующей низким разведениям вируса) они часто сливаются друг с другом. Время появления и морфология бляшек зависят от вида и штамма вируса, типа клеток и условий куль­тивирования.

В основу титрования вирусов положены наблюдения Дальбекко и Фогт, показавших линейную зависимость между дозой внесенного вируса и количеством образующихся бляшек. Они показали, что для образования одной бляшки достаточно одной инфекционной вирус­ной частицы. Однако это положение верно при определенных усло­виях, и прежде всего при внесении в культуру больших разведении вирусов, исключающих возможность множественного заражения клеток.

^ Цветная проба. Цветную пробу для лабораторных исследований впервые предложили Солк, Яигнер и Уорд в 1954г. Предпосылкой для разработки данного метода явились наблюдения Эндсрса, Уэллера и Роббинса, которые отметили, что в незараженных тканевых культурах под влиянием продуктов метаболизма рН среды сдвига­ется в кислую сторону, что улавливается по пожелтению фенолрота, добавленного в питательную среду. В то же время жидкость в ткане­вых культурах, зараженных вирусом, убивающим живые клетки, со­храняла свой красный цвет.

Наиболее отчетливые результаты дают вирусы с высокой скорос­тью размножения при культивировании их на медленнорастущих клетках.

Так как метод цветной пробы не отличается высокой достоверно­стью, его в практике используют редко.

Обнаружение внутриклеточных включений. При многих вирус­ных заболеваниях в клетках (в цитоплазме или ядре) различных ор­ганов и тканей появляются особые образования, называемые тельца­ми-включениями. Их классифицируют по локализации в клетке, со­ставу нуклеиновой кислоты, тинкториальным свойствам и гомоген­ности.

Тельца-включения локализуются избирательно: при оспе, грип­пе, бешенстве, парагриппе и других болезнях, как правило, развива­ются цитонлазматические включения; при ринотрахеит крупного рогатого скота, ларинготрахеите птиц, аденовирусной инфекции и других - ядерные.

Для приготовления препаратов культур клеток с целью выявле­ния телец-включений клетки выращивают на покровных стеклах в пробирках или пенициллиновых флаконах, заражают испытуе­мым материалом и через определенные сроки инкубации при 37 °С - (что зависит от свойств инокулированного вируса) стекла выни­мают, промывают в теплом растворе Хенкса или физиологичес­ком растворе (рН 7,0 - 7,2), подсушивают фильтровальной бума­гой и фиксируют в одной из фиксирующих смесей: растворе Буэна - 10 - 15 мин, фиксаторе Карнуа - 10, Ценкера - 20 - 30, метиловом спирте - 15 мин или в других фиксаторах. Затем препараты окрашивают.

Вирусные тельца-включения хорошо обнаруживаются в препара­тах, окрашенных гематоксилин-эозин ом. Для этого фиксированные на покровных стеклах клетки промывают в дистиллированной воде и погружают на 5 - 15 мин в раствор гематоксилина (гематоксилин Майера, Эрлиха, Карацци и др.). Время окрашивания подбирают эм­пирически для каждой культуры клеток и краски. Затем препараты отмывают водой и помещают на 1 - 2 мин в аммиачную воду (на 200 мл дистиллированной воды добавляют 2 - 3 капли аммиака). В щелочной среде ядра клеток приобретают синий цвет. Далее препа­раты окрашивают 0,1 %-ным водным раствором эозина 30 - 60 с, удаляют лишнюю влагу фильтровальной бумагой, проводят по спиртам возрастающей концентрации: 70, 80, 96 (первый раз), 96 (второй раз), 100° + ксилол (1:1), ксилол и заключают в бальзам. В каждом из спир­тов и ксилоле препараты держат не более 1 мин. Перед перенесени­ем препаратов в следующую бюксу обязательно снимают с него фильтровальной бумагой лишнюю влагу, иначе спирт будет обводняться. При окраске гематоксилин-эозином ядра клеток окрашиваются в си­ний цвет, цитоплазма - в розовый, а тельца-включения - в синий или розовый в зависимости от вируса.

Для обнаружения телец-включений при гриппе довольно часто используют окраску культур клеток по методу Клисенко. Для этого стекла с зараженной культурой клеток споласкивают теплым (37 °С) физиологическим раствором и фиксируют в жидкости Дюбоска - Бразила - Буэна от 20 мин до нескольких недель. Тщательно от­мытые (3 - 4 раза) в дистиллированной воде объекты окрашива­ют 10 мин 1%-ным раствором акридинового оранжевого, тща­тельно отмывают дистиллированной водой, затем снова окрашива­ют 1%-ным раствором эозина 30 мин, промывают дистиллирован­ной водой и допропитывают раствором (1:1000) метиленового синего. Последний готовят перед употреблением из 1%-ноги маточного раствора.

Окрашенные препараты промывают дистиллированной водой, дифференцируют в подкисленном (2 - 3 капли ледяной уксусной кис­лоты на 50 мл спирта) абсолютном спирте до появления розово-си­него оттенка. Обезвоживают абсолютным спиртом и, проводя через ксилол, заключают в бальзам. Цитоплазма окрашивается в нежно-розовый цвет, ядро - в розово-сиреневый, ядрышки - в. синий, ви­русные включения - в ярко-красный

Для окраски клеток крови, костного мозга или культур кле­ток из лимфоидных органов обычно применяют окраску по методу Романовского - Гимзы.

В вирусологической практике для обнаружения телец-включений довольно часто используют метод простого флуорохромирования с применением акридинового оранжевого.

Обнаружение вирусов в реакции иммунофлуоресценции. В том слу­чае, если размножение вируса в культуре клеток не сопровождается цитопатическим эффектом, гемадсорбцией, его присутствие можно обнаружить с помощью флуоресцирующих антител. Этот метод ши­роко используют при диагностике классической чумы свиней, парвовирусной инфекции свиней и других болезней.

^ Метод, основанный на интерференции вирусов. Построен на том, что некоторые вирусы в культуре клеток снижают способность размножаться в ней других вирусов. Например, вирус чумы свиней снижает инфекционную активность вируса ящура, вирус ньюкаслской болезни - вируса везикулярного стоматита и т. д.

Обычно этот метод применяют для обнаружения вирусов, кото­рые не вызывают ЦПД в культуре клеток. Так, для обнаружения вируса чумы свиней в культуре клеток (он не вызывает ЦПД) эту инфицированную культуру заражают вторым вирусом (ящура) в дозе не менее 100 ТЦД50 и инкубируют в термостате при 37 °С. Через несколько дней проводят учет под микроскопом. Если в культуре клеток не обнаруживают ЦПД, значит, в ней находится вирус чумы свиней. Если во всех пробирках ЦПД, значит, вируса чумы нет и вирус ящура проявляет цитопатогенное действие. Метод интерфе­ренции используют даже для титрования вирусов, не вызывающих ЦПД.

^ Получение первично-трипсинизированных культур клеток из кожно-мышечной ткани развивающихся куриных эмбрионов. Ку­риные эмбрионы 9 - 11-дневной инкубации овоскопируют. От­бирают яйца с подвижными эмбрионами и хорошо выраженны­ми сосудами. На скорлупе простым карандашом отмечают границы воздушной камеры и расположение зародыша.

Поверхность скорлупы протирают йодированным спиртом и обжигают. Стерильными ножницами срезают скорлупу на 2 - 3 мм выше границы воздушной камеры, разрывают подскорлупную и хорионаллантоисную оболочки и за шейку извлекают эм­брион в стерильную чашку Петри (рис. 12).



9 10

Рис. 12. Схема получения культуры клеток куриного эмбриона:

1 - извлечение эмбриона; 2 - удаление головы, конечностей и внутренностей; 3 -

промывание; 4 - пробная три псин юани я; 5 - объединение взвеси клеток в сосуде на льду; 6 - центрифугирование и удаление трипсина; 7 - ресуспендирование осадка и подсчет клеток; 8 - доведение концентрации клеток до необходимой для посева; 9 - посев клеток в пробир­ки и матрасы; 10 - инкубация в термостате

У эмбриона удаляют голову, лапки, крылья и внутренние органы. Оставшийся кожно-мышечный мешок переносят в стерильную майонезную банку (250 мл) и измельчают ножницами на кусочки 3 - 4 мм.

Измельченную ткань 2 - 3 раза отмывают раствором Хенкса от слизи и кровяных элементов до получения прозрачных сливных вод и переносят в колбу для трипсинизации. В колбу наливают 0,15%-ный раствор трипсина, подогретого до 35 - 37 °С (соотноше­ние ткани и трипсина 1:3), вносят стерильный магнитик и ставят на магнитную мешалку

Трипсинизацию проводят дробно, т. е. через каждые 3 - 5 мин отделившиеся клетки вместе с трипсином сливают в центрифужные флаконы и помещают на лед или в холодильник для прекра­щения действия трипсина на клетки. К оставшемуся в колбе со­держимому добавляют новую порцию трипсина. Скорость вра­щения на магнитной мешалке регулируют так, чтобы не было пены. Процесс повторяют несколько раз (3 - 5) до полного истощения ткани.

После трипсинизации суспензию клеток в растворе трипсина центрифугируют при 1000 мин 10 мин, надосадочную жидкость сливают (выбрасывают), а осадок клеток ресуспендируют в теплой (37 °С) питатель­ной среде (в заведомо известном объеме) и фильтруют через 3-слойный марлевый фильтр.

После тщательного перемешивания кле­ток берут 1 мл для подсчета клеток.

Успех культивирования клеток в значи­тельной степени зависит от посевной дозы. При малом количестве клеток не на­блюдается образования монослоя даже при длительном культивировании. При слиш­ком большой дозе клеток происходит ин­тенсивная их пролиферация, и образован­ный слой клеток значительно раньше под­вергается старению и неспецифической дегенерации. Клетки подсчитывают в ка­мере Горяева.

К 1 мл взвеси клеток добавляют равный объем 0,1%-ного раство­ра кристаллвиолета, приготовленного на 0,1 н. растворе лимонной кислоты. После перемешивания камеру заполняют взвесью клеток и подсчитывают все клетки, имеющие ядро и неповрежденную цито­плазму; группу клеток с явными контурами считают за одну клетку.

На основании подсчета клеток в двух камерах высчитывают сред­нее арифметическое в одной из них. Число клеток в 1 мл суспензии (X) определяют по формуле

Х = (А-2-1000) : 0,9,

где А - среднее число клеток в одной камере; 2 - коэффициент разведения суспен­зии добавленным объемом краски; 1000 - число мм3 в 1 см3; 0,9 - объем камеры Горяева, мм3.

После подсчета суспензию клеток разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось от 700 тыс. до 1 млн кле­ток (для куриных фибробластов).

Пример. В 1 мл полученной суспензии клеток (100 мл) содержится 4 млн клеток. Следовательно, всего в 100 мл суспензии 400 млн клеток. Посевная концен­трация - 1 млн клеток в 1 мл. Исходную суспензию клеток (100 мл) доводят росто­вой питательной средой до 400 мл.

Затем суспензию разливают в матрасы или пробирки. В пробирки заливают по 1 мл, в матрасы вместимостью 1000, 250 и 100 мл вносят соответственно 100,40 и 15 мл взвеси клеток. Сосуды и пробирки плот­но закрывают стерильными резиновыми пробками (для предупреждения защелачивания среды), делают надпись (вид культуры клеток и дату). На пробирках восковым карандашом проводят продольную чер­ту, укладывают их чертой вверх в лотки с наклонным углом 5° С и поме­щают в термостат при 37 °С.

Ежедневно культуры просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера роста. Если клетки не пролиферируют, выглядят округлыми, зернистыми, темными и отслаива­ются от стекла, это свидетельствует о плохой обработке посуды или токсичности сыворотки, питательной среды. Пролиферирующие клет­ки светлые, связаны цитоплазматическими отростками, растут однослойным пластом. В процессе размножения клеток выделяются про­дукты обмена веществ, которые вызывают изменение рН питатель­ной среды в кислую сторону (среда желтеет), что отрицательно вли­яет на клетки и может привести их к гибели. Такую среду заменяют свежей. Обычно сплошной монослой куриные фибробласты образу­ют через 36 - 48 ч.

От одного куриного эмбриона получают 70 - 120 млн клеток. Куль­туры клеток куриных фибробластов используют при работе с виру­сом болезни Ауески, оспы птиц, ньюкаслской болезни, гриппа птиц, вируса саркомы Рауса и др.
Контрольные вопросы

1. Какие виды культур клеток вам известны и какова их характеристика?

2. Какие растворы и питательные среды применяют при культивировании клеток?

3. Какова методика получения первично-трипсинизированных культур клеток?

4. Как используются культуры клеток в вирусологии?

5. Какова методика заражения культур клеток вирусами?

6. Какие методы индикации вирусов в культуре клеток вы знаете?

7. В чем преимущества культур клеток перед другими лабораторными сис­темами?

1   2   3   4   5   6

Похожие:

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования iconФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение...
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования iconФедеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального...
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования iconФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение...
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования iconФедеральное государственное автономное образовательное учреждение...
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования iconФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение...
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования iconФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение...
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования iconФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение...
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования iconМинистерство образования и науки российской федерации федеральное...
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования iconМинистерство образования и науки Российской Федерации Федеральное...
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования iconМинистерство образования и науки российской федерации федеральное...
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2013
контакты
litcey.ru
Главная страница